BIOMARCADORES- DR ORY

 

DISCURSO Dr.ORY: BIOMARCADORES PARA LA ENFERMEDAD DE NPC.

Gracias a Steven y a Frances por introducir el tema del que yo voy a hablar ahora. Como ha explicado Frances la identificación de biomarcadores es vital en el estudio de la enfermedad de NPC y también ha comentado por qué necesitamos estos biomarcadores y su utilidad dentro de este campo. La investigación que estamos llevando a cabo en nuestro laboratorio es complementaria y se centra en los biomarcadores químicos presentes en la sangre que sirven para el diagnóstico de la enfermedad y su nivel de gravedad.

El principal obstáculo con el que nos encontramos para desarrollar terapias para la enfermedad de NPC es la inexistencia de una simple prueba de diagnóstico. En los últimos años se están llevando a cabo muchos ensayos para identificar los marcadores específicos de la enfermedad. De entre todos ellos nos hemos centrado en los marcadores bioquímicos, lo que significa que podemos medirlos mediante muestras de sangre o tejido.

Uno de los motivos por el que hemos podido llevar este proyecto adelante ha sido gracias a la ayuda de uno de nuestros compañeros, Deni Porter, del Instituto Nacional de Salud en EEUU. Hace unos 4 años Deni decidió que necesitábamos un historial clínico nacional para la enfermedad de NPC, de tal manera que podamos aprender y conocer más sobre ella. De esta forma pudimos crear un lugar donde los pacientes pueden ir, ser evaluados y recibir un seguimiento del progreso de la enfermedad. Al mismo tiempo, podemos archivar las muestras de los pacientes a lo largo de su progresión y usarlas para intentar identificar nuevos químicos y marcadores que pueden decirnos más sobre la naturaleza de la enfermedad. Gracias a su ayuda hemos podido avanzar en este campo.

Existen varios laboratorios que están investigando diferentes biomarcadores y trabajando de forma conjunta para la enfermedad de NPC. Frances está trabajando con la morfometría lisomática, Porter está trabajando con el plasma y el estudio de todas las proteínas presentes en el líquido cerebro espinal. El tema que yo voy a presentar es el del colesterol oxidado y también me gustaría ofrecer una breve introducción sobre los lípidos presentes en el plasma. Nuestro objetivo es encontrar la acumulación de grasa en la sangre porque ésta es una fuente de información en la búsqueda de biomarcadores.

La razón por la que decidimos estudiar el colesterol oxidado es porque sabemos que las células con NPC viven en un medio ambiente oxidado. También sabemos que las células con NPC acumulan gran cantidad de colesterol, por lo que parece ser que una combinación entre este ambiente oxidado y el colesterol podría 1) aumentar el colesterol oxidado o 2) ser una característica específica de la enfermedad. Decidimos llevar a cabo el estudio en ratones y posteriormente en humanos.

Abajo podéis ver una imagen de la apariencia del colesterol y las diferentes formas en su estado oxidado (diapositiva en la siguiente página). Estos son sólo algunos ejemplos, por lo que decidimos comprobar cuáles son los más comunes.

 

Mientras Deni estaba ocupado creando el historial nacional para humanos, nosotros decidimos poner en marcha el ensayo en ratones que es más fácil y rápido. Nos dimos cuenta de que sólo vivían 11 semanas más o menos y como podéis ver aquí (diapositiva en la siguiente página), sus pesos tienden a bajar con el tiempo por razones metabólicas y falta de una dieta adecuada, en especial al final de su ciclo de vida. Lo que también observamos es que los síntomas de la enfermedad empezaron a aparecer a las 6 o 7 semanas de vida, tal y como vemos en la diapositiva. Los observamos mientras realizaban una sucesión de actividades y los ratones sanos (representados en las barras grises) no mostraron ninguna dificultad para llevarlas a cabo. Sin embargo, los ratones con NPC empezaron a mostrar signos de dificultad a las 6 o 7 semanas de vida, y definitivamente a las 7 semanas mostraron dificultades en la coordinación. Casi al final de su ciclo de vida apenas podían realizar ninguna actividad.

 

Esto nos proporcionó un modelo para entender que ocurre a las 6 o 7 semanas de vida en lo que respecta al cambio de biomarcadores y, decidimos estudiar las especies de colesterol oxidado. Observamos diferentes tejidos del cerebro, hígado y bazo. También medimos plasma, porque últimamente estamos interesados en encontrar un marcador que pueda detectarse con un simple análisis de sangre.

 

No voy a mostrar todos los datos, pero sí un ejemplo de lo que sucede en la sangre con estos biomarcadores (diapositiva siguiente página). La clave es la diferencia entre los dos modelos, gris (normal) y negro (NPC) en función del colesterol oxidado. Aquí hay 4 especies representadas. En la diapositiva superior izquierda podemos ver que a las 4 semanas los ratones con NPC presentan características muy similares a los ratones sanos. En la diapositiva superior derecha se puede observar que no hay diferencias significativas en las primeras semanas de vida, pero cuando tienen 7 semanas aparecen los síntomas. Cuando descubrimos esto nos preguntamos si quizás estamos ante marcadores que pueden decirnos 1) qué ratones son los afectados frente a los que no lo están y 2) la posibilidad de la acumulación de especies a medida que la enfermedad va progresando.

 

Basándonos en las muestras de pacientes obtenidas por Deni, tomamos pacientes con NPC1, algunos de los hermanos y padres y también muestras de individuos sanos para poder hacer la comparativa.

 

Los resultados fueron interesantes. Al comienzo estudiamos varias especies pero fuimos reduciéndolas hasta 2 o 3 que creímos que eran verdaderamente relevantes. A una de ellas la llamamos especie del ensayo y a otra 7 Kilo colesterol. Las barras rojas (diapositiva siguiente página) representan los individuos sanos, las azules los hermanos y/o padres de pacientes afectados con NPC1 y, las negras son los pacientes con NPC1. Lo que se puede apreciar en las dos gráficas superiores es que los pacientes con NPC se separan bastante de las otras 2, lo que indica que estas especies son muy específicas para la enfermedad de NPC y de hecho, si observamos la gráfica inferior izquierda vemos una gran diferencia entre la barra de los pacientes con NPC y la de los individuos sanos y familiares. Otro punto que merece la pena destacar si miramos de cerca aquí (gráfica superior izquierda), es que la barra azul parece estar flotando lo que abre la posibilidad de que el mismo proceso que ocurre en la enfermedad de NPC también puede ocurrir, aunque en menor proporción, en las células de los familiares.

 

Si observamos los dos marcadores de la gráfica inferior derecha podemos ver la correlación entre las barras roja y azul. Esto indica que es muy probable que el proceso de oxidación haya estado produciendo especies de ensayo y de colesterol. Este modelo nos permite estudiar al paciente bajo esos parámetros, con lo que todos los pacientes con NPC quedan situados a la derecha de la gráfica, mientras que el grupo de individuos sanos aparece en la esquina inferior izquierda. Esto es lo que sería un resultado positivo en oposición a uno negativo.

Otra especie de colesterol oxidado es el 24-HC. La razón por la que menciono esta especie es porque es la única con la que podemos medir en la sangre y es específica para la sangre del cerebro. Todas las 24-HC que circulan en la sangre han sido producidas en el cerebro y forman una parte importante en el ciclo de vida del colesterol en el cerebro. Todo el colesterol que llega al cerebro se produce de forma local y sigue un proceso para eliminar estas 24-HC de la sangre, por lo que el cerebro tiene que devolver el colesterol. Y este proceso ocurre en las neuronas hidro, que son las que resultan afectadas en la enfermedad de NPC. Algo que ya conocemos de otros estudios y en especial de otras enfermedades neuro-degenerativas como el Alzheimer, es que las neuronas resultan afectadas a la vez que se reduce su habilidad para producir colesterol 24-HC. Cuando observamos las células en los ratones el nivel de colesterol 24-HC también se ve reducido. Esto demuestra que la enfermedad de NPC presenta una firma similar a la de otras enfermedades degenerativas.

Cuando se desarrolla un biomarcador siempre nos preguntamos sobre su especificidad. Si encontramos el mismo metabolismo para todas las enfermedades entonces no estamos ante un biomarcador muy útil. Queremos encontrar biomarcadores en las enfermedades lisosomáticas y por eso tuvimos en cuenta diferentes enfermedades lisosomáticas, entre ellas NPC, y observamos los niveles de estos marcadores (diapositiva página siguiente).

 

La cantidad de marcadores presentes en NPC fue mayor para casi todos los marcadores y en especial para el colesterol 7K. Éste mostró mayores niveles en NPC que en ninguna otra enfermedad de almacenamiento lisosomático, lo que demuestra la especificidad del marcador.

Otro factor importante es el estrés oxidativo (medio ambiente altamente oxidado) que podemos encontrar en enfermedades neurodegenerativas, cardiovasculares y diabetes. Lo que queremos saber es si estamos ante un marcador que funciona para el estrés oxidativo o es realmente estrés oxidativo más colesterol, algo bastante específico de NPC. Basándonos en los resultados obtenidos creemos que aunque los marcadores presentan bastantes similitudes, el estrés oxidativo es algo específico de la enfermedad.

Otro factor importante es la gravedad de la enfermedad. Aunque aún no tenemos todos los datos del estudio de Deni, sí utilizamos su sistema para seguir la progresión de la enfermedad con el fin de saber quién presenta la enfermedad de forma más y menos avanzada. Esto nos proporcionó algunas especies y biomarcadores con los que trabajar.

Pero, una vez que has encontrado el biomarcador en animales ¿cómo lo trasladamos a la población humana? Pues bien, trabajamos de forma conjunta con algunas instituciones e investigadores, y llevamos a cabo un ensayo de biomarcadores que finalizó en 2009. Aún estamos analizando los resultados del mismo y la realidad es que el descubrimiento de biomarcadores ayudaría también a proporcionar un diagnóstico y, creo que el uso de la tecnología nos ayuda a conseguir los mejores resultados.

En la actualidad estamos llevando a cabo algunos ensayos con otros biomarcadores y creo que vamos a conseguir muy buenos resultados en el próximo año o 2 años. Y por supuesto si tuviéramos la posibilidad de establecer un diagnóstico prematuro podríamos desarrollar nuevas terapias. Muchas gracias.

 

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